Replicação do DNA

A síntese do DNA é um processo complexo, que compreende aspetos bioquímicos, genéticos e fisiológicos. São estes processos que determinam a estrutura e a função do material genético¹. A replicação um processo fundamental para a função celular e para a manutenção da saúde, para o qual contribuem dezenas de proteínas, enzimas e outros fatores².

Nucleótidos

Um nucleótido é um composto orgânico constituído por uma base azotada de purina ou pirimidina unidas a um açúcar (ribose ou desoxirribose) e a um ou mais grupos fosfato. Os nucleótidos que contém ribose são conhecidos como ribonucleótidos (ou RNA), e aqueles que contém desoxirribose como desoxirribonucleótidos (ou DNA), em que o hidroxilo na posição 2 do anel de ribose é substituído por um átomo de hidrogénio¹.

Os anéis de azoto são geralmente referidos como bases, por razões históricas: sob condições ácidas podem captar um ião H+ e assim aumentar a concentração de iões OH- em solução aquosa.

Existem 5 nucleótidos fundamentais e cada um é designado a partir da base que contém.

Citosina (C), timina (T) e uracilo (U) são designadas de pirimidinas porque todos derivam de um anel de pirimidina de seis lados. Guanina (G) e adenina (A) são compostos de purina e possuem um duplo anel de cinco átomos de carbono.

O RNA contém os nucleótidos A, G, C e U. O DNA contém as bases A, G, C e T ( T é quimicamente semelhante à do U no RNA, apenas com a adição do grupo metilo no anel de pirimidina). O RNA normalmente existe nas células sob a forma de uma única cadeia de polinucleótidos.

Watson e Crick propuseram que o DNA existe sob a forma de uma molécula de cadeia dupla, constituída por duas cadeias polinucleotídicas antiparalelas entre si e unidas por pontes de hidrogénio. Assim, as duas cadeias de polinucleótidos da dupla hélice de DNA estão associadas através de ligações de hidrogénio em que G emparelha especificamente com C  e A emparelha especificamente com T (no caso do DNA) ou U (no do RNA). A esta ligação específica e complementar dá-se o nome de emparelhamento de bases. É esta ligação purina-pirimidina que permite que o DNA mantenha uma largura constante².

A direcção dos nucleótidos de uma cadeia é oposta à direcção dos nucleótidos da outra cadeia (antiparalela). As terminações assimétricas das cadeias de DNA são designadas terminais 5′ (cinco linha) e 3′ (três linha). Assim, ao longo da dupla hélice de DNA, uma cadeia tem a direcção 5′-3′, enquanto a outra tem a direcção 3′-5′.

Como as pontes de hidrogénio não são ligações covalentes, podem ser quebradas e reunidas com relativa facilidade. Desta forma, as duas cadeias da dupla hélice de DNA podem ser separadas como um fecho de correr, através de força mecânica ou de altas temperaturas. Como resultado desta complementariedade, toda a informação contida numa das cadeias de DNA está também contida na outra, o que é fundamental para a sua replicação.

Os nucleótidos funcionam como blocos de construção para a formação dos ácidos nucleicos. Entre si, os nucleótidos estão ligados de forma covalente através de uma ligação fosfodiéster entre o grupo fosfato ligado ao açúcar de um nucleótido e um grupo hidroxilo no açúcar do nucleótido seguinte. As cadeias de ácidos nucleicos são sintetizadas a partir de nucleósidos trifosfato ricos em energia, através de uma reacção de condensação que liberta pirofosfato inorgânico durante a formação da ligação fosfodiéster.

Replicação do DNA

Quando as células se dividem, cada célula filha tem de receber uma cópia do genoma. Para que isto aconteça o DNA tem de ser replicado (ou copiado) mesmo antes ou durante a divisão celular³.  Assim, replicação é o processo através do qual a cadeia de DNA se duplica para que a divisão celular aconteça².

A síntese de duas novas cadeias polinucleotídicas, complementares e anti-paralelas a partir de cada uma das cadeias da molécula original, resulta na formação de duas moléculas filhas rigorosamente idênticas à molécula parental. Assim, através da replicação do DNA, cada célula ao dividir-se dá origem a duas células cujo conteúdo genético é idêntico ao da célula original.

Tendo por base a estrutura em dupla hélice do DNA proposta por Watson e Crick em 1953 foram propostos inicialmente três mecanismos de replicação alternativos, como representado na figura G1:

1. Replicação conservativa – Neste modelo a totalidade da dupla molécula de DNA serve como molde para uma nova molécula de DNA, sendo a molécula de DNA original totalmente conservada durante a replicação.
2. Replicação dispersiva – Neste modelo ambas as cadeias nucleotídicas se quebram em diversos fragmentos, que servem de molde para a síntese de novos fragmentos de DNA. Sendo assim, cada molécula de DNA é constituída por fragmentos de DNA da molécula mãe e por fragmentos sintetizados de novo.
3. Replicação semiconservativa – Neste modelo as duas cadeias que constituem a dupla hélice de DNA separam-se e cada uma serve de molde para a síntese de uma nova cadeia. Como resultado obtêm-se duas cadeias duplas, cada uma constituída por uma cadeia mãe e uma cadeia sintetizada de novo.

Em 1957, as experiências realizadas por Meselson e Stahl demonstraram que a replicação do DNA se processava de acordo com o modelo semiconservativo, tal como representado na figura G2.

A replicação em organismos eucariotas apresenta algumas diferenças relativamente a organismos procariotas.

Apesar da sua grande dimensão, os cromossomas eucariotas possuem milhares origens de replicação, denominadas sequências de replicação autónomas, o que permite que o processo decorra de uma forma relativamente rápida. Em cada garfo de replicação, a velocidade de replicação acontece entre 500 a 5000 nucleótidos por minuto²!

O primeiro passo para a replicação é separar as duas moléculas de DNA, dando origem a um garfo de replicação (local onde a cadeia de DNA está separada e a replicação se inicia – figura G3). Cada cadeia de DNA serve de molde para uma nova cadeia. Em cada origem de replicação, a molécula de DNA desenrola-se e forma uma bolha de replicação (origem de replicação).

 

A replicação inicia-se em ambas as cadeias de DNA de forma bidirecional e anti-paralela. Quando os garfos de replicação adjacentes se encontram dá-se a sua fusão. O resultado é a formação de duas moléculas de DNA lineares idênticas.

A síntese de DNA ocorre simultaneamente em ambas as cadeias molde, sendo o seu crescimento sempre no sentido 5´ para 3´.

Cada nucleótido é adicionado à nova cadeia de DNA pela ligação do seu grupo fosfato presente no carbono 5´ da desoxirribose, ao grupo hidroxilo do carbono 3´ da desoxirribose do último nucleótido presente na cadeia em crescimento (figura G4). Quando um nucleótido está a ser adicionado a uma cadeia de DNA em síntese, ocorre a formação de uma ligação fosfodiéster com o fosfato proximal do nucleótido à cadeia em crescimento. Esta ligação é acompanhada por hidrólise de uma ligação de fosfato de alta energia com libertação de dois fosfatos distais sob forma de pirofosfato³.

Para que a replicação aconteça, em primeiro lugar é necessário que a molécula de DNA molde seja desnaturada através de uma enzima denominada DNA helicase. Esta enzima é responsável pela abertura do garfo de replicação através da quebra das pontes de hidrogénio que mantêm a dupla hélice de DNA.

A fase seguinte, a síntese da nova cadeia de DNA, utiliza como molde uma cadeia mãe complementar, e é realizada por uma DNA polimerase⁴. Contrariamente aos organismos procariotas, os organismos eucariotas apresentam um elevado número de DNA polimerases² (tabela G1) que para além da sua participação na replicação, também desempenham funções na reparação e recombinação do DNA.

Para iniciarem a síntese de DNA, todas as DNA polimerases necessitam de um nucleótido com um grupo 3´-OH ao qual um novo nucleótido possa ser adicionado. Isto é conseguido pela adição de um primer, isto é, uma pequena sequência de nucleótidos de RNA sintetizada por uma enzima denominada RNA primase^4,5. Como a primase é uma RNA polimerase não necessita da pré-existência de um grupo 3´-OH livre.

A DNA polimerase tem atividade restrita no sentido de 5′ para 3′.

Uma vez que a DNA polimerase tem atividade restrita no sentido 5´ para 3´, e que as cadeias molde são anti-paralelas, uma das cadeias molde de DNA é replicada continuamente, leading strand, enquanto que a outra cadeia molde de DNA é replicada de forma descontínua, lagging strand.

Na síntese da lagging strand, existe a formação de vários fragmentos de pequeno tamanho de DNA sempre a partir de um primer, denominados fragmentos de Okasaki.

Para que possa ocorrer a fusão destes fragmentos de DNA e seja formada uma única cadeia, entra em ação outra DNA polimerase (tabela G1) responsável por substituir os nucleótidos de RNA do primer por nucleótidos de DNA, assim como a DNA ligase, uma enzima responsável por formar uma ligação fosfodiester entre o grupo 3´-OH do último nucleótido que foi adicionado e o grupo 5´ fosfato do nucleótido seguinte^1,3,6.

Para além destas enzimas, existem proteínas que se ligam à cadeia simples da molécula de DNA responsáveis por manter as cadeias de DNA desnaturadas e estáveis, denominadas proteínas de ligação à cadeia simples.

Uma outra enzima, denominada topoisomerase, impede a acumulação de super-enrolamentos na cadeia dupla atrás do garfo de replicação, aliviando a torção por fazer uma quebra na dupla cadeia de DNA.

Pelo facto de os cromossomas eucariotas serem lineares, a DNA polimerase não consegue replicar o segmento terminal da lagging strand. Isto acontece porque quando o primer de RNA no final do cromossoma é removido, deixa de haver um grupo 3´-OH que possibilite a adição de nucleótidos pela DNA polimerase. A consequência seria o encurtamento dos telómeros a cada ciclo de replicação. Desta forma, a replicação dos telómeros não é efetuada de forma convencional, sendo esta região final replicada por uma enzima denominada telomerase^2,7.

Os telómeros possuem uma extremidade protuberante constituída por repetições de um conjunto de seis nucleótidos TTAGGG. A telomerase reconhece esta extremidade estabelecendo ligação com o DNA através de complementariedade. Isto acontece porque esta enzima é constituída no seu interior por uma cadeia simples de RNA que serve de molde para a extensão dos telómeros no sentido 5´ para 3’, possibilitando a adição de novos nucleótidos à medida que a telomerase se desloca pela cadeia de DNA molde.

A última fase da replicação acontece com a remoção da telomerase e a síntese da extremidade em falta é replicada com a adição de um primer e de uma DNA polimerase.

 

Tabela G1 – DNA polimerases nos eucariotas.

Adaptado de: Pierce BA. Genetics: A Conceptual Approach. W. H. Freeman; 2013.

DNA Polimerase	Atividade 5’-3’	Atividade 3’-5’	Função
Alpha	Sim	Não	Iniciação da síntese do DNA e reparação Tem atividade primase
Beta	Sim	Não	Reparação e recombinação do DNA
Gamma	Sim	Sim	Reparação e recombinação do DNA mitocondrial
Delta	Sim	Sim	Síntese das cadeias Leading e Lagging Reparação do DNA
Epsilon	Sim	Sim	Síntese da cadeia Leading
Zeta	Sim	Não	Síntese DNA
Eta	Sim	Não	Síntese DNA
Theta	Sim	Não	Reparação do DNA
Iota	Sim	Não	Síntese DNA
Kappa	Sim	Não	Síntese DNA
Lambda	Sim	Não	Reparação do DNA
Mu	Sim	Não	Reparação do DNA
Sigma	Sim	Não	Reparação do DNA Coesão das cromátides irmãs
Phi	Sim	Não	Síntese DNA
Rev1	Sim	Não	Reparação do DNA

 

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Referências Bibliográficas

1. Kornberg A, Baker TA. DNA Replication. University Science; 2005.
2. Pierce BA. Genetics: A Conceptual Approach. W. H. Freeman; 2013.
3. Clark DP, Pazdernik NJ. Molecular Biology. Elsevier Science; 2012.
4. Lewin B. Genes: VII. Oxford University Press, Incorporated; 2000.
5. Ptashne M, Gann A. Genes and Signals. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002.
6. Krebs JE, Lewin B, Goldstein ES, Kilpatrick ST. Lewin’s GENES XI. Jones & Bartlett Learning; 2014.
7. Hood L, Hartwell L, Fischer J, Aquadro C, Goldberg M. Genetics: From Genes to Genomes. McGraw-Hill Education; 2014.