Marcação inespecífica e métodos de bloqueio

Autor: Carla Lopes. Ver página autores.
Última edição: Pathologika, 18 de Setembro de 2016
Citar esta página: Lopes, C., Marcação inespecífica e métodos de bloqueio – Pathologika. Available at: https://pathologika.com/imuno-histoquimica/marcacao-inespecifica-e-metodos-de-bloqueio/ [Acedido: data].

A marcação de fundo inespecífica (background), quando intensa, dificulta ou torna mesmo impossível a interpretação de reacções imunohistoquímicas fracas.

Existem dois aspectos principais que podem ser causa de marcação de fundo:

(1) a ligação inespecífica do anticorpo aos componentes tecidulares, seja por ligações hidrofóbicas ou interacções iónicas,

(2) a presença de enzimas endógenas. O background pode também ser atribuído à presença de biotina endógena.

A primeira resulta do facto dos anticorpos serem moléculas altamente carregadas e terem afinidade para alguns componentes do tecido, nomeadamente o colagénio. Esta ligação pode levar à marcação falsamente positiva do colagénio e de outros componentes tecidulares, obscurecendo a marcação específica de interesse.

Para reduzir a marcação inespecífica do anticorpo ao tecido é  aconselhada a pré-incubação do tecido com soro normal.

Em teoria, este bloqueio funciona uma vez que as proteínas no soro normal vão ocupar os locais no tecido que estão carregados, reduzindo desta forma a ligação inespecífica do anticorpo ao tecido. O soro normal utilizado deve ser da mesma espécie do anticorpo secundário, para que não interfira na reacção imunológica que ocorre no procedimento de imunohistoquímica. Outra forma de evitar este tipo de marcação inespecífica é  a utilização de tampão de lavagem com detergente.

O bloqueio da actividade das enzimas endógenas é  também muito importante para reduzir a marcação inespecífica.

A utilização de métodos imunohistoquímicos que apresentam como marcador enzimas semelhantes às que existem no tecido (endógenas), podem gerar problemas de marcação inespecífica, uma vez que as enzimas endógenas podem reagir com o substrato usado para localizar o marcador e levantar problemas de interpretação e falsos positivos.

Peroxidase endógena

A actividade da peroxidase endógena está naturalmente presente nos eritrócitos (pseudoperoxidade), granulócitos (mieloperoxidase), hepatócitos, neurónios do sistema nervoso central e tecidos sensíveis aos estrogénios e não é inactivada durante a fase de fixação e processamento.

método mais utilizado para o bloqueio da peroxidase endógena utiliza metanol com peróxido de hidrogénio. No entanto, há autores que acreditam que esta combinação é muito drástica e pode causar a desnaturação de alguns antigénios. Podem também ser utilizadas com resultado, soluções de peróxido de hidrogénio em água.

Por norma, o bloqueio da peroxidase endógena é efectuado antes da incubação do anticorpo primário. No entanto, devem ser tomadas precauções com certos antigénios (nomeadamente o CD4 e o BCL6), uma vez que longos períodos de incubação na solução de bloqueio ou uma concentração demasiado elevada de peróxido de hidrogénio, pode diminuir significativamente a marcação em tecidos incluidos em parafina e fixados em formol. Para este tipo de anticorpos mais sensíveis, o método de bloqueio da peroxidase deve ser efectuado após a ligação do anticorpo primário ao antigénio do tecido.

Fosfatase alcalina endógena

A actividade da fosfatase alcalina endógena é normalmente bloqueada pela adição de levamisol à solução de substrato. Quando utilizado a uma concentração de 1 mM, o levamisol inibe selectivamente certos tipos de fosfatase alcalina, mas não a intestinal ou a placentar. Nestas situações, uma solução de ácido acético glacial a 20% deve ser utilizada, uma vez que inibe todos os tipos de fosfatase alcalina.

Biotina endógena

A biotina é uma coenzima hidrossolúvel essencial para o crescimento e bem estar dos mamíferos e alguns microorganismos. Foi das primeiras vitaminas a ser isolada, inicialmente como um factor de crescimento microbiano e subsequentemente como necessária aos mamíferos. As suas funções no organismo estão relacionadas com o metabolismo dos lípidos e utilização do dióxido de carbono. Originalmente denominada vitamina H, foi isolada na sua forma pura em 1935, e a estrutura estabelecida em 1942.

É uma substância estável, com um peso molecular de 244.3D cuja fórmula química é C10H16O3N2S (Figura I6). Encontra-se principalmente na gema do ovo, em alguns microorganismos e nos mamíferos, nomeadamente no fígado, pulmão, baço, tecido adiposo, mama, rim e cérebro.

Figura I6 - Estrutura da biotina. Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Biotina#mediaviewer/File:Biotin_structure.svg

Figura I6 – Estrutura da biotina.
Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Biotina#mediaviewer/File:Biotin_structure.svg

 

Devido à localização da biotina nas mitocôndrias, o background provocado pela biotina endógena é mais evidente no estudo de células ou tecidos metabolicamente activos e que apresentam numerosas mitocôndrias na sua constituição, tais como fígado e rim.

A utilização de sistemas de detecção que contêm avidina na sua constituição para detectar antigénios em tecidos ricos em biotina, pode ocasionar problemas de marcação inespecífica, que se traduzem numa coloração finamente granular do citoplasma.

Esta marcação verifica-se uma vez que o complexo avidina-biotina estabelece ligações a qualquer vestígio de biotina existente no tecido, resultando na deposição de cromogénio no local. A extrema afinidade da avidina para a biotina juntamente com o facto de a cada molécula de avidina se poderem ligar quatro moléculas de biotina, sugere que qualquer ligação inespecífica da avidina para a biotina endógena pode ser bloqueada.

Como efectuar o bloqueio da biotina endógena?

Para evitar dificuldades de diagnóstico e resultados falsamente positivos, é necessário o passo adicional de bloqueio da biotina endógena (Figura I7 – 1). Após a aplicação de uma solução de avidina no tecido (Figura I7 – 2), esta é saturada com uma solução de biotina (Figura I7 – 3) para bloqueio de qualquer receptor de biotina ainda livre na avidina, seguindo-se a remoção do excesso de biotina. Deste modo, o sistema de bloqueio impede a ligação de avidina ou biotina nos passos subsequentes da técnica imunohistoquímica.

Fig I7.Bloqueio da biotina endógena

Um outro método de bloqueio da biotina endógena foi proposto por Miller et al (1997). Para o efeito, as lâminas são imersas numa solução de clara de ovo (duas claras de ovo diluídas em água destilada até perfazer um volume final de 200 ml) durante 15 minutos tendo os autores obtido resultados significativos.