Métodos imunohistoquímicos

Autor: Carla Lopes. Ver página autores.
Última edição: Pathologika, 18 de Setembro de 2016
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As técnicas de imunohistoquímica são utilizadas para demonstrar a presença de antigénios em tecidos e células. O facto de as imunoglobulinas poderem atuar tanto como anticorpos (ligando-se especificamente aos antigénios do tecido) como antigénios (providenciando determinantes antigénicos aos quais se podem ligar anticorpos secundários), permitiu que fossem desenvolvidas vários métodos (técnicas) para visualizar o antigénio alvo.

A base dos sistemas de deteção é o reconhecimento específico do antigénio pelo anticorpo, seguindo-se a sua visualização. Esta deteção é alcançada com a incubação do anticorpo primário anti o antigénio pretendido no tecido. É seguida da aplicação com os reagentes incluídos no sistema de deteção, que agregam certos marcadores aos anticorpos primários ou secundários. O passo final é a visualização desta ligação com a aplicação do cromogénio.

Em todos os métodos imunohistoquímicos, o essencial é conseguir a máxima quantidade de marcador no local do antigénio alvo com o mínimo de background.

São vários os métodos em imunohistoquímica que nos permitem detetar o antigénio pretendido no tecido do paciente. Atualmente, as técnicas imunohistoquímicas podem ser efetuadas em equipamentos completamente automatizados, embora a técnica manual seja ainda amplamente executada.

Método direto

Neste método, o anticorpo primário é conjugado diretamente com o marcador (fluorocromo ou enzima). Desta forma, o anticorpo marcado reage diretamente com o antigénio na amostra de histologia ou de citologia, permitindo assim a sua visualização (Figura I8).

Esta técnica é mais utilizada em imunofluorescência para demonstração de imunoglobulinas e complemento em cortes de congelação de amostras de pele e biópsia renal.

Como desvantagens deste método, referem-se a pouca amplificação de sinal assim como a pouca sensibilidade alcançada quando comparado a outros métodos. Convém mencionar que a pouca quantidade de antigénio presente em certos tumores podem não ser detetados por esta técnica.

Figura I8 - Método direto.

Figura I8 – Método direto.

Método indireto

Neste método, é aplicado na amostra um anticorpo primário não conjugado (anti o antigénio que queremos visualizar), seguido de um anticorpo secundário conjugado com um marcador (Figura I9). Salienta-se que o anticorpo secundário deve ser dirigido à espécie animal em que o anticorpo primário foi produzido, ou seja, se o anticorpo primário é de rato, o anticorpo secundário deve ser, por exemplo, coelho anti-rato.

Este método é mais sensível do que o método direto porque os múltiplos anticorpos secundários podem reagir com diferentes locais antigénicos no anticorpo primário, aumentando assim a amplificação de sinal.

 

Figura I9 - Método indireto.

Figura I9 – Método indireto.

Método Peroxidase Anti-Peroxidase

Para que o anticorpo secundário (anticorpo ponte) se possa ligar tanto ao anticorpo primário como ao complexo peroxidase anti-peroxidase (PAP), o complexo PAP deverá ser produzido na mesma espécie animal do anticorpo primário (Figura I10).

O anticorpo secundário deve ser aplicado em excesso para que uma porção Fab se ligue ao anticorpo primário e a outra porção Fab se ligue ao complexo PAP.

Figura I10 - Método PAP.

Figura I10 – Método PAP.

Método Fosfatase Alcalina Anti-Fosfatase Alcalina

Para que o anticorpo secundário (anticorpo ponte) se possa ligar tanto ao anticorpo primário como ao complexo fosfatase alcalina anti-fosfatase alcalina (APAAP) , o complexo APAAP deverá ser produzido na mesma espécie animal do anticorpo primário (Figura I11).

O anticorpo secundário deve ser aplicado em excesso para que uma porção Fab se ligue ao anticorpo primário e a outra porção Fab se ligue ao complexo APAAP.

Figura I11 - Método APAAP.

Figura I11 – Método APAAP.

 

Métodos de Avidina e Biotina

Complexo avidina-biotina (ABC) OU streptavidina-biotina (sABC)

De acordo com Elias (1988), para a época, um dos métodos mais sensíveis utilizados para o diagnóstico imunocitoquímico envolve o uso da avidina e da biotina. Os métodos de avidina-biotina foram desenvolvidos por Guesdon, Ternynck e Avrameas em 1979, mas o seu aperfeiçoamento foi efetuado em 1981 por HSU, Raine e Fanger.

Estes métodos baseiam-se na elevada afinidade da molécula tetravalente  avidina (glicoproteína com 68kD extraída da clara do ovo) para a biotina.

Por esta afinidade ser mais de um milhão de vezes superior que a do anticorpo para o antigénio, esta ligação é praticamente irreversível o que permite a formação de complexos avidina-biotina particularmente estáveis. Tanto a biotina como a avidina podem ser conjugadas covalentemente com anticorpos ou com marcadores, como por exemplo fluorocromos, enzimas ou ouro coloidal. No entanto, é a biotina a geralmente conjugada aos anticorpos devido ás suas reduzidas dimensões (Rainbow, 1994). Cada anticorpo pode conjugar até 150 moléculas de biotina, o que permite a ligação de vários complexos e explica a elevada sensibilidade deste método na deteção do antigénio alvo. De referir que a biotinilação do anticorpo secundário não reduz a eficácia da sua atividade (HSU,  Cossman,  Jaffe, 1983).

No entanto, a avidina possui resíduos oligossacarídeos na sua estrutura. Estes elementos induzem a ligação da avidina a estruturas tecidulares de carga elétrica negativa, o que provoca marcação de fundo inespecífica. Para ultrapassar este problema, começou a ser utilizada a streptavidina.

A streptavidina é uma proteína de 60 KD, extraída da cultura de Streptomyces avidinii, que não possui resíduos oligossacarídeos, pelo que não induz marcação de fundo inespecífica.

A execução deste método consiste na incubação do anticorpo primário, seguido de um anticorpo secundário  biotinilado e do complexo streptavidina-biotina conjugado com a enzima horseradish peroxidase (HRP) (Figura I12).

Quando se utilizam sistemas de deteção baseados neste método em tecidos ricos em biotina endógena (fígado, tecido adiposo, mama e rim), torna-se necessário efetuar o seu bloqueio de modo a evitar o aparecimento de resultados falsamente positivos (Wood e Warnke, 1981).

A preparação do complexo sABC pode ser efetuada até 3 horas antes da sua incubação. É adicionada streptavidina e biotina marcada com a enzima para que as duas moléculas se liguem. A quantidade de cada reagente adicionado deve proporcionar que exista uma zona livre na streptavidina por cada três ocupadas com biotina marcada, para que o complexo se possa ligar à biotina do anticorpo secundário.

Figura I12 - Método sABC (streptavidina-biotina)

Figura I12 – Método sABC (streptavidina-biotina)

Complexo Labelled Streptavidin Biotin (LSAB)

Uma variante ao complexo ABC ou sABC, consiste em não utilizar biotina conjugada com a avidina ou a streptavidina. Neste método, a streptavidina é conjugada diretamente com a enzima (Figura I13).

Figura I13 - Método LSAB.

Figura I13 – Método LSAB.

Método do polímero

Esta metodologia utiliza uma cadeia de dextrano, conjugada com anticorpos e enzimas. Cada cadeia de dextrano pode ter até 70 moléculas de enzima e 10 moléculas de anticorpo ligado. Este composto é facilmente solúvel em água e eletrólitos, constituindo soluções incolores, transparentes e altamente estáveis.

O facto destes sistemas não possuírem avidina / streptavidina nem biotina na sua constituição, torna-se desnecessário efetuar o bloqueio da biotina endógena.

Método Enhanced Polymer One-Step Staining (EPOS)

Esta tecnologia utiliza um anticorpo primário conjugado a uma cadeia de polímero (dextrano), marcada com uma enzima (peroxidase de rábano) o qual se liga diretamente ao antigénio no tecido (Figura I14). Um bom exemplo deste método é o Enhanced Polymer One-Step Staining (EPOS).

Figura I14. Método EPOS

Figura I14. Método EPOS

Método indireto

Neste método, os polímeros são ligados de forma indireta ao anticorpo primário, ou seja, em primeiro lugar incuba-se o anticorpo primário no tecido e depois é adicionado o polímero (Figura 15). Desta forma, a cadeia de dextrano, além da enzima, é também conjugada com anticorpos secundários. Estes anticorpos secundários reconhecem tanto anticorpos primários produzidos em rato (anti-rato) como anticorpos primários produzidos em coelho (anti-coelho), o que permite que o mesmo reagente possa ser utilizado para detetar tanto anticorpos primários monoclonais (de coelho e de rato) assim como anticorpos primários policlonais (coelho).

Figura I15 - Método polímero indireto.

Figura I15 – Método polímero indireto.

Micropolímeros ou multímeros

Nesta tecnologia, a enzima é diretamente conjugada ao anticorpo secundário por micropolímeros, eliminando a molécula de polímero maior (dextrano) que pode limitar a funcionalidade e sensibilidade do método (figuras I16 e I17).
Como a molécula de multímero é mais pequena, penetra facilmente no tecido o que facilita a ligação de mais multímeros ao anticorpo primário. Este processo aumenta a sensibilidade de marcação deste método, o que se torna uma grande mais valia em tecidos com baixos níveis de antigénio alvo.

Figura I16 - Método micropolímero

Figura I16 – Método micropolímero

Uma variante a este método do micropolímero, consiste num passo intermédio de incubação com um anticorpo secundário para amplificação de sinal.

Figura I7 - Método micropolímero em 2 passos.

Figura I7 – Método micropolímero em 2 passos.

 

Além destas, que são as mais utilizadas, existem outras metodologias utilizadas em imunohistoquímica para deteção do antigénio alvo. A última década foi de grande evolução e descoberta nestas técnicas, com o objetivo de ser detetado o antigénio alvo, mesmo quando presente em ínfimas quantidades no tecido do doente. E a evolução continuará, sempre com um único objetivo presente: a deteção do antigénio alvo para um diagnóstico e terapêutica corretos.