Produção de anticorpos monoclonais e policlonais

Autor: Carla Lopes. Ver página autores.
Última edição: Pathologika, 11 de Março de 2017
Citar esta página: Lopes, C., Produção de anticorpos monoclonais e policlonais – Pathologika. Available at: https://pathologika.com/imuno-histoquimica/anticorpos-imunoglobulinas/producao-de-anticorpos-monoclonais-e-policlonais/ 
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A maioria dos antigénios oferece múltiplos epítopos o que induz a proliferação e diferenciação de uma variedade de clones de células B. Cada um destes clones derivado de uma célula B reconhece um epítopo específico. Os anticorpos séricos resultantes são heterogéneos, compreendendo uma mistura de anticorpos, cada um específico para um epitopo – anticorpos policlonais. A resposta imunológica do anticorpo policlonal facilita a localização, a fagocitose e lise do antigénio mediada pelo complemento, tendo vantagens claras para o organismo in vivo. Infelizmente, a heterogeneidade do anticorpo que aumenta a protecção imunitária in vivo, muitas vezes reduz a eficácia de um anticorpo para uma variedade de utilizações in vitro.

Anticorpos policlonais

O primeiro passo para a produção de um anticorpo é a purificação do antigénio para o qual queremos produzir um anticorpo. Isto pode ser realizado através de técnicas de purificação como a cromatografia e a eletroforese.

Segue-se a imunização do animal com o antigénio de interesse. Este passo é realizado injetando no animal (coelho, cabra, cavalo, etc.) o antigénio juntamente com um conjunto de substâncias que ativam o sistema imunológico, denominados de coadjuvantes. Após alguns dias, o sangue do animal é colhido e através de centrifugação é separado o plasma sanguíneo (soro), dos restantes elementos celulares. É no plasma que se encontram os anticorpos.

Este soro pode ser utilizado logo após a centrifugação (soro total ou “whole serum”), pois a grande maioria dos anticorpos ali presentes são os anticorpos sintetizados contra o antigénio injetado. Além dos anticorpos, este soro total também contém proteínas.

Para a obtenção de um soro mais puro, é importante separar a fração das imunoglobulinas específicas das proteínas (soro de fração de imunoglobulinas ou “Ig fraction”). Este grau de purificação é geralmente é realizado através de cromatografia por afinidade, na qual se usa a a proteína A ou o próprio antigénio como fase estacionária numa coluna de afinidade, sendo que o anticorpo purificado é libertado da coluna através do uso de uma solução com pH 2,5.

Anticorpos monoclonais

Para fins de pesquisa, diagnóstico e terapêuticos, são preferíveis os anticorpos monoclonais, que derivam de um único clone e, portanto, específicos para um único epitopo.
Poder-se-ia pensar na purificação bioquímica directa de um anticorpo monoclonal a partir de uma preparação de anticorpo policlonal, mas tal não é viável.

Em 1975, Georges Köhler e Cesar Milstein desenvolveram um método para a preparação de anticorpos monoclonais. Após imunizarem ratinhos com determinado antigénio, as células do baço são colhidas. São seleccionadas as células B normais, produtoras de anticorpos, que ao serem fundidas com uma célula de mieloma (plasmócito tumoral), geram uma célula híbrida, denominada hibridoma. Este hibridoma possui as propriedades de crescimento das células imortais do mieloma e segrega o anticorpo produzido pela célula B. Os clones resultantes de células de hibridoma, que segregam grandes quantidades de anticorpos monoclonais, podem ser cultivados indefinidamente.

As células do baço do ratinho permitem a produção do anticorpo específico, ao passo que a célula de mieloma fornece a capacidade do hibridoma crescer indefinidamente em cultura e deste modo segregar imunoglobulina continuamente. Ao utilizar células de mieloma (que não têm a capacidade de produzir anticorpos), o anticorpo produzido pelas células híbridas provém apenas das células do baço imunizado. Após a fusão, as células híbridas são seleccionadas utilizando drogas que matam as células de mieloma não fundidas, enquanto que as células do baço não fundidas têm um tempo de vida limitada e morrem, de modo que apenas os hibridomas sobrevivem. Os hibridomas que produzem anticorpos da especificidade desejada são identificados e clonados para uma cultura de células individuais. Uma vez que cada clone de hibridoma é um derivado da fusão com uma única célula B, todas as moléculas de anticorpo que ela produz são idênticas em estrutura, incluindo o seu local de ligação ao antigénio e isótipo. Tais anticorpos são designados por anticorpos monoclonais (Figura I4). O significado do trabalho por Köhler e Milstein foi reconhecido quando cada um foi agraciado com o Prémio Nobel.

Fig I4.Produção de anticorpos mono e policlonais

 

Esta tecnologia tem revolucionado a utilização de anticorpos, fornecendo uma fonte ilimitada de um anticorpo de especificidade única e conhecida. Os anticorpos monoclonais podem ser utilizados em ensaios serológicos, como sondas de diagnóstico em imunohistoquímica e como agentes terapêuticos.

 

Haptenos

O acoplamento químico de um hapteno a uma proteína grande, chamada transportador, produz um complexo imunogénico hapteno-proteína. Os animais imunizados com tais complexos, podem produzir anticorpos específicos para:

  • o determinante hapteno,
  • epítopos não alterados na proteína transportadora,
  • novos epítopos formados por partes combinadas do hapteno e do transportador.

Por si só, um hapteno não pode funcionar como um epítopo imunogénico. Mas quando múltiplas moléculas de um único hapteno são acoplados a uma proteína transportadora, o hapteno torna-se acessível para o sistema imunitário e pode funcionar como um imunogénio. Muitas substâncias biologicamente importantes, incluindo medicamentos, hormonas peptídicas e esteróides, podem funcionar como haptenos. Os complexos destes haptenos com transportadores proteicos, podem ser utilizados para produzir anticorpos específicos para o hapteno.

Vantagens e desvantagens dos anticorpos monoclonais

A grande vantagem dos anticorpos monoclonais é a sua especificidade absoluta para reconhecer e se ligar a um único epitopo na molécula de antigénio.
Desta forma, os problemas associados a marcação inespecífica com os anticorpos policlonais, devido à reactividade cruzada, são normalmente inexistentes. No entanto, a especificidade única para um determinado epítopo, não exclui necessariamente a reactividade cruzada. Ou seja, se o anticorpo monoclonal é dirigido para um epitopo e essa sequência de aminoácidos é partilhada por mais do que um antigénio, o anticorpo monoclonal não oferece vantagem sobre um policlonal.

Uma possível desvantagem do anticorpo monoclonal deriva da sua especificidade. Comparando a sensibilidade e especificidade dos anticorpos monoclonais e policlonais, verifica-se que o anticorpo policlonal pode ser mais sensível, mas menos específico do que o anticorpo monoclonal. Este facto pode ser explicado porque o anticorpo policlonal reconhece vários epítopos diferentes numa única proteína (antigénio), o que proporciona uma forte capacidade de detecção, enquanto que um anticorpo monoclonal reconhece apenas um único tipo de epítopo, o que pode resultar em menos moléculas de anticorpo a ser ligado ao antigénio, resultando em marcação mais fraca.

Da mesma forma, no anticorpo monoclonal, o epitopo de interesse da proteína pode ser alterado por meio da fixação ou de processamento, ficando portanto indisponível para a reacção, resultando em nenhuma marcação imunohistoquímica. Este facto explica porque é que alguns anticorpos monoclonais só reagem com amostras a fresco ou em cortes de congelação e não com amostras fixadas e incluídas em parafina.