Hematoxilina & Eosina

Autor: Carla Lopes. Ver página autores.
Última edição: Pathologika, 26 de Fevereiro de 2016
Citar esta página: Lopes, C., Hematoxilina & Eosina – Pathologika. Available at: https://pathologika.com/histoquimica/hematoxilina-eosina/ [Acedido: data].

Objetivo / Princípio

A hematoxilina e eosina (H&E) é a principal coloração em anatomia patológica e provavelmente a mais utilizada em histologia. Permite a visualização de vários constituintes celulares, nomeadamente do núcleo, citoplasma e tecido conjuntivo. A hematoxilina cora os núcleos de azul e a eosina  cora o tecido conjuntivo e o citoplasma em diferentes tonalidades de vermelho, rosa ou laranja.

Protocolos de Hematoxilina & Eosina (H&E)

Serão apresentados dois tipos de procedimento técnico, conforme se pretenda corar com a hematoxilina de forma progressiva ou de forma regressiva.

Método progressivo

Cora progressivamente o núcleo celular sem ser necessário recorrer à diferenciação.

1. Xilol 10 min
2. Álcool a 99,9% 3 min
3. Álcool a 96% 2 min
4. Água corrente 4 min
5. Hematoxilina (Gill ou Mayer) 5 min
6. Água corrente 4 min
7. Água amoniacal a 0,5% 15 seg
8. Água corrente 4 min
9. Eosina / Eosina-Floxina 20 seg / 1 min
10. Água corrente 5 seg
11. Álcool a 96% 5 seg
12. Álcool a 99,9% 15 seg
13. Álcool a 99,9% 30 seg
14. Xilol 3 min
15. Xilol 3 min
NOTAS
  1. Os tempos em cada um dos passos da coloração são meramente indicativos e devem ser adaptados de acordo com as preferências de cada laboratório.
  2. Não agitar no passo da água amoniacal, pois pode ocorrer queda de cortes da lâmina.
  3. A água amoniacal pode ser substituída por qualquer das soluções “azulantes” mencionadas.
Resultados

Núcleos ………………………………. azul

Citoplasma ………………………….. vários tons de rosa

Fibras musculares ……………….. rosa intenso / vermelho

Eritrócitos ……………………………. laranja / vermelho

Fibrina ………………………………… rosa intenso

Note-se que outras estruturas e substâncias que não os núcleos, podem corar pela hematoxilina. Exemplos incluem hifas fúngicas, que coram fracamente, e depósitos de cálcio, que coram frequentemente de azul-preto.


Método regressivo

Cora intensamente todas as estruturas nucleares e citoplasmáticas, sendo necessário recorrer à diferenciação.

1. Xilol 10 min
2. Álcool a 99,9% 3 min
3. Álcool a 96% 2 min
4. Água corrente 4 min
5. Hematoxilina (Harris) 10 min
6. Água corrente 4 min
7. Álcool ácido a 1% 5 seg
8. Água corrente 7 min
9. Eosina / Eosina-Floxina 20 seg / 1 min
10. Água corrente 5 seg
11. Álcool a 96% 5 seg
12. Álcool a 99,9% 15 seg
13. Álcool a 99,9% 30 seg
14. Xilol 3 min
15. Xilol 3 min
NOTAS
  1. Quando a hematoxilina é usada regressivamente, o passo da diferenciação é fundamental. Os núcleos não devem ficar sobre ou sub-diferenciados, pois coloração nuclear inapropriada pode condicionar o diagnóstico.
  2. Os tempos em cada um dos passos da coloração são meramente indicativos e devem ser adaptados de acordo com as preferências de cada laboratório.
Resultados

Núcleos ………………………………. azul

Citoplasma ………………………….. vários tons de rosa

Fibras musculares ……………….. rosa intenso / vermelho

Eritrócitos …………………………… laranja / vermelho

Fibrina ………………………………… rosa intenso

Note-se que outras estruturas e substâncias que não os núcleos, podem corar pela hematoxilina. Exemplos incluem hifas fúngicas, que coram fracamente, e depósitos de cálcio, que coram frequentemente de azul-preto.


Método rápido para cortes de congelação

Antes de iniciar a coloração, certificar que o corte está bem aderido à lâmina histológica.

1. Água corrente 30 seg
2. Hematoxilina 1 min
3. Água corrente 10 seg
4. Água amoniacal 3 seg
5. Água corrente 5 seg
6. Eosina 5 seg
7. Água corrente 1 seg
8. Álcool a 96% 5 seg
9. Álcool a 99,9% 5 seg
10. Xilol 5 seg
Resultados

Núcleos …………………………………………………………… azul

Citoplasma e outros componentes tecidulares ……… vários tons de rosa


Dicas para uma boa coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

  1. Efetuar diariamente uma lâmina teste antes de se iniciar a coloração de rotina. Este passo permite perceber, após visualização microscópica, se algum dos corantes ou reagentes necessita ser trocado.
  2. Não permitir que as lâminas sequem durante o processo de coloração.
  3. Quando não estão a ser utilizados, manter sempre os reagentes tapados. Este passo evita que os reagentes evaporem e que os álcoois absorvam a humidade atmosférica.
  4. Certificar que todos os reagentes tem volume suficiente para que as lâminas fiquem imersas.
  5. Filtrar a hematoxilina sempre que seja verificado precipitado na superfície da solução.
  6. Efetuar manutenção diária dos reagentes (mudar), considerando o número de lâminas coradas diariamente.
  7. Perceber se aconteceu mudança de lote ou de fornecedor da hematoxilina. Ajustar o tempo de coloração se necessário.
  8. Verificar o pH da hematoxilina. Ajustar se necessário.
  9. Após o passo da água amoniacal, lavar bem as lâminas em água corrente. O pH da eosina é fundamental para se alcançar uma boa coloração citoplasmática. Se for transportada amónia para a eosina, o pH será alterado e a coloração afetada.
  10. Após o passo da eosina, não desidratar as lâminas muito rapidamente. Este passo é fundamental para uma boa diferenciação deste corante. No entanto, quanto mais diluído for o álcool, maior a quantidade de eosina removida.
  11. Uma boa desidratação é fundamental. Considerar trocar diariamente o último álcool absoluto assim como o último xilol.
  12. Excesso de cloro na água corrente, pode resultar em coloração nuclear fraca. Se for este o caso, considerar substituir a água corrente por água desionizada ou destilada.
  13. Por vezes, o que aparenta ser um problema de coloração, tem origem em fases anteriores de processamento histológico. Rastrear o tempo de fixação dos fragmentos, a condição dos reagentes do processador de tecidos, a espessura do corte histológico assim como temperatura excessiva em alguma das fases prévias, devem ser formas de verificar eventuais problemas na coloração.