Hematoxilina & Eosina

Objetivo / Princípio

A hematoxilina e eosina (H&E) é a principal coloração em anatomia patológica e provavelmente a mais utilizada em histologia. Permite a visualização de vários constituintes celulares, nomeadamente do núcleo, citoplasma e tecido conjuntivo. A hematoxilina cora os núcleos de azul e a eosina  cora o tecido conjuntivo e o citoplasma em diferentes tonalidades de vermelho, rosa ou laranja.

Protocolos de Hematoxilina & Eosina (H&E)

Serão apresentados dois tipos de procedimento técnico, conforme se pretenda corar com a hematoxilina de forma progressiva ou de forma regressiva.

Método progressivo

Cora progressivamente o núcleo celular sem ser necessário recorrer à diferenciação.

1.	Xilol	10 min
2.	Álcool a 99,9%	3 min
3.	Álcool a 96%	2 min
4.	Água corrente	4 min
5.	Hematoxilina (Gill ou Mayer)	5 min
6.	Água corrente	4 min
7.	Água amoniacal a 0,5%	15 seg
8.	Água corrente	4 min
9.	Eosina / Eosina-Floxina	20 seg / 1 min
10.	Água corrente	5 seg
11.	Álcool a 96%	5 seg
12.	Álcool a 99,9%	15 seg
13.	Álcool a 99,9%	30 seg
14.	Xilol	3 min
15.	Xilol	3 min

NOTAS

1. Os tempos em cada um dos passos da coloração são meramente indicativos e devem ser adaptados de acordo com as preferências de cada laboratório.

2. Não agitar no passo da água amoniacal, pois pode ocorrer queda de cortes da lâmina.

3. A água amoniacal pode ser substituída por qualquer das soluções “azulantes” mencionadas.

Resultados

Núcleos ………………………………. azul

Citoplasma ………………………….. vários tons de rosa

Fibras musculares ……………….. rosa intenso / vermelho

Eritrócitos ……………………………. laranja / vermelho

Fibrina ………………………………… rosa intenso

Note-se que outras estruturas e substâncias que não os núcleos, podem corar pela hematoxilina. Exemplos incluem hifas fúngicas, que coram fracamente, e depósitos de cálcio, que coram frequentemente de azul-preto.

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Método regressivo

Cora intensamente todas as estruturas nucleares e citoplasmáticas, sendo necessário recorrer à diferenciação.

1.	Xilol	10 min
2.	Álcool a 99,9%	3 min
3.	Álcool a 96%	2 min
4.	Água corrente	4 min
5.	Hematoxilina (Harris)	10 min
6.	Água corrente	4 min
7.	Álcool ácido a 1%	5 seg
8.	Água corrente	7 min
9.	Eosina / Eosina-Floxina	20 seg / 1 min
10.	Água corrente	5 seg
11.	Álcool a 96%	5 seg
12.	Álcool a 99,9%	15 seg
13.	Álcool a 99,9%	30 seg
14.	Xilol	3 min
15.	Xilol	3 min

NOTAS

1. Quando a hematoxilina é usada regressivamente, o passo da diferenciação é fundamental. Os núcleos não devem ficar sobre ou sub-diferenciados, pois coloração nuclear inapropriada pode condicionar o diagnóstico.

2. Os tempos em cada um dos passos da coloração são meramente indicativos e devem ser adaptados de acordo com as preferências de cada laboratório.

Resultados

Núcleos ………………………………. azul

Citoplasma ………………………….. vários tons de rosa

Fibras musculares ……………….. rosa intenso / vermelho

Eritrócitos …………………………… laranja / vermelho

Fibrina ………………………………… rosa intenso

Note-se que outras estruturas e substâncias que não os núcleos, podem corar pela hematoxilina. Exemplos incluem hifas fúngicas, que coram fracamente, e depósitos de cálcio, que coram frequentemente de azul-preto.

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Método rápido para cortes de congelação

Antes de iniciar a coloração, certificar que o corte está bem aderido à lâmina histológica.

1.	Água corrente	30 seg
2.	Hematoxilina	1 min
3.	Água corrente	10 seg
4.	Água amoniacal	3 seg
5.	Água corrente	5 seg
6.	Eosina	5 seg
7.	Água corrente	1 seg
8.	Álcool a 96%	5 seg
9.	Álcool a 99,9%	5 seg
10.	Xilol	5 seg

Resultados

Núcleos …………………………………………………………… azul

Citoplasma e outros componentes tecidulares ……… vários tons de rosa

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Dicas para uma boa coloração de hematoxilina e eosina (H&E)

1. Efetuar diariamente uma lâmina teste antes de se iniciar a coloração de rotina. Este passo permite perceber, após visualização microscópica, se algum dos corantes ou reagentes necessita ser trocado.
2. Não permitir que as lâminas sequem durante o processo de coloração.
3. Quando não estão a ser utilizados, manter sempre os reagentes tapados. Este passo evita que os reagentes evaporem e que os álcoois absorvam a humidade atmosférica.
4. Certificar que todos os reagentes têm volume suficiente para que as lâminas fiquem imersas.
5. Filtrar a hematoxilina sempre que seja verificado precipitado na superfície da solução.
6. Efetuar manutenção diária dos reagentes (mudar), considerando o número de lâminas coradas diariamente.
7. Perceber se aconteceu mudança de lote ou de fornecedor da hematoxilina. Ajustar o tempo de coloração se necessário.
8. Verificar o pH da hematoxilina. Ajustar se necessário.
9. Após o passo da água amoniacal, lavar bem as lâminas em água corrente. O pH da eosina é fundamental para se alcançar uma boa coloração citoplasmática. Se for transportada amónia para a eosina, o pH será alterado e a coloração afetada.
10. Após o passo da eosina, não desidratar as lâminas muito rapidamente. Este passo é fundamental para uma boa diferenciação deste corante. No entanto, quanto mais diluído for o álcool, maior a quantidade de eosina removida.
11. Uma boa desidratação é fundamental. Considerar trocar diariamente o último álcool absoluto assim como o último xilol.
12. Excesso de cloro na água corrente, pode resultar em coloração nuclear fraca. Se for este o caso, considerar substituir a água corrente por água desionizada ou destilada.
13. Por vezes, o que aparenta ser um problema de coloração, tem origem em fases anteriores de processamento histológico. Rastrear o tempo de fixação dos fragmentos, a condição dos reagentes do processador de tecidos, a espessura do corte histológico assim como temperatura excessiva em alguma das fases prévias, devem ser formas de verificar eventuais problemas na coloração.

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Referências bibliográficas

1. Carson, F.L., 1997. Histotechnology: a self-instructional text. 2ª ed., ASCP Press.       
2. Carleton, H.M., Drury, R.A.B. & Wallington, E.. A., 1976. Carleton’s Histological Technique. 4a., Oxford University Press.   
3. Bancroft, J.D. & Cook, H.C., 1984. Manual of Histological Techniques. Churchill Livingstone.   
4. Prophet, E.B. & Armed Forces Institute of Pathology, 1992. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, DC. American Registry of Pathology.
5. Lillie, R.D., 1965. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. 3ª ed., McGraw-Hill Book Company.
6. Bancroft, J.D., Gamble, M. & Suvarna, S.K., 2012. Theory and Practice of Histological Techniques. 7a., Elsevier Churchill Livingstone.