Hematoxilina de Harris
É a hematoxilina mais utilizada em histologia para a coloração do núcleo celular. Por ser considerada um corante regressivo, é necessária uma diferenciação ácida após a coloração, de modo a ser alcançada a intensidade de coloração nuclear desejada. A adição de ácido acético glacial à solução final de hematoxilina, aumenta a sua especificidade e seletividade nuclear.
Tempo de coloração entre 5 a 10 minutos.
Este corante está disponível para compra em solução comercial pronta a usar.
Reagentes
Hematoxilina ……………………………………. 1 g
Álcool a 99,9% (100%) ……………………… 10 mL
Alúmen de potássio ou amoniacal ………. 20 g
Água destilada …………………………………. 200 mL
Óxido de mercúrio ……………………………. 0,5 g
Ácido acético glacial………………………….. 10 mL
Preparação da solução
Dissolver a hematoxilina no álcool.
Dissolver o alúmen na água quente.
Misturar as duas soluções cuidadosamente e voltar a aquecer a mistura o mais rápido possível.
Quando em ebulição, retirar do calor e adicionar o óxido de mercúrio.
Levar de novo a solução ao calor até que o ponto de ebulição seja de novo alcançado e aguardar que adquira cor roxo escuro (2 a 3 minutos).
Arrefecer rapidamente em água corrente.
Filtrar depois de fria e adicionar o ácido acético glacial.
Armazenar em frasco escuro bem fechado.
Filtrar sempre antes de usar.
NOTAS
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Nesta solução, o alúmen é o mordente e o óxido de mercúrio é o agente oxidante. Devido à elevada toxicidade do óxido de mercúrio, o iodato de sódio (0,07g) pode ser usado como agente oxidante substituindo o óxido de mercúrio. O ácido acético previne a formação de precipitado de alúmen na superfície da solução da solução de hematoxilina..
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O pH da hematoxilina situa-se entre 2.22 e 2.95.
Hematoxilina de Mayer
Esta hematoxilina é muito seletiva para corar a cromatina nuclear. Por ser considerada um corante progressivo não é necessário o passo de diferenciação, e quando utilizada como coloração nuclear de rotina deve ser considerado aumentar o tempo de coloração. Esta solução quase não cora os mucopolissacáridos. É a hematoxilina recomendada como contraste das lâminas de imunohistoquímica sempre que é utilizado o cromogénio 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), pois a hematoxilina de Mayer não contém álcool.
Tempo de coloração entre 5 a 10 minutos.
Este corante está disponível para compra em solução comercial pronta a usar.
Reagentes
Hematoxilina ……………………………………. 1 g
Iodato de sódio ………………………………… 0,2 g
Alúmen de potássio ou amoniacal ………. 50 g
Ácido cítrico …………………………………….. 1 g
Hidrato de cloral ……………………………….. 50 g
Água destilada …………………………………. 1000 mL
Preparação da solução
De acordo com a literatura, esta solução pode ser preparada por diferentes métodos sendo qualquer um deles eficaz.
Método 1
Dissolver a hematoxilina na água.
Adicionar o iodato de sódio.
Adicionar o alúmen, o ácido cítrico e o hidrato de cloral.
Homogeneizar os reagentes num agitador magnético.
Armazenar em frasco bem fechado.
Método 2
Dissolver a hematoxilina na água.
Aquecer a solução até ao ponto de ebulição e deixar em ebulição por 5 minutos.
Retirar do calor e aguardar que a ebulição termine.
Adicionar o iodato de sódio.
Deixar a oxidar durante 10 minutos.
Adicionar o alúmen, o ácido cítrico e o hidrato de cloral.
Homogeneizar os reagentes num agitador magnético.
Armazenar em frasco bem fechado.
Método 3
Dissolver a hematoxilina na água, juntamente com o iodato de sódio e o alúmen.
Deixar overnight.
Adicionar o ácido cítrico e o hidrato de cloral.
Aquecer a solução até ao ponto de ebulição e deixar em ebulição por 5 minutos.
Deixar arrefecer.
Armazenar em frasco bem fechado.
NOTAS
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Nesta solução, o alúmen é o mordente e o iodato de sódio é o agente oxidante. O ácido cítrico ajusta o pH e o hidrato de cloral atua como um preservante assim como ajuda a prevenir a precipitação do alúmen na superfície da solução de hematoxilina.
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O pH da hematoxilina situa-se entre 2.22 e 2.95.
Hematoxilina de Gill
A hematoxilina de Gill é mais utilizada do que a hematoxilina de Mayer como coloração de rotina, e é mais estável do que a hematoxilina de Harris. Isto acontece porque a auto-oxidação é em certa medida inibida e a sua capacidade corante mantém-se durante alguns meses. Uma das desvantagens inclui a a coloração das células de Gobelet. A outra, menos importante, inclui a eventual coloração de lâminas modificadas eletrostaticamente.
A formulação Gill nº 1 é utilizada como corante citológico progressivo e as formulações de Gill nº 2 e nº 3 podem ser utilizadas como corantes progressivos ou regressivos, dependendo do tipo de coloração. A solução de Gill nº 3 é a mais concentrada e pode ser utilizada para corar cortes em metacrilato.
Tempo de coloração entre 5 a 10 minutos (quando usada progressivamente).
Este corante está disponível para compra em solução comercial pronta a usar.
Reagentes
Hematoxilina anidro ………………………………. 2 g
OU
Hematoxilina ………………………………………… 2,36g
Iodato de sódio …………………………………….. 0,2 g (± 0,01 g)
Sulfato de alumínio, Al2(SO4)3 *18H20 …… 17,6 g
Ácido acético glacial ……………………………… 20 mL
Etileno glicol …………………………………………. 250 mL
Água destilada ……………………………………… 730 mL
Preparação da solução
Dissolver a hematoxilina no etileno glicol.
Dissolver o sulfato de alumínio na água.
Misturar as duas soluções cuidadosamente.
Adicionar o iodato de sódio.
Adicionar o ácido acético glacial.
Filtrar sempre antes de usar.
Armazenar em frasco escuro bem fechado.
NOTAS
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Nesta solução, o alumínio é o mordente e o iodato de sódio é o agente oxidante. O etileno glicol assim como o ácido acético previnem a formação de precipitado de alúmen na superfície da solução da solução de hematoxilina.
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As células caliciformes (ou de Goblet), são coradas com a hematoxilina de Gill.
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A solução de Gill 2 pode ser preparada duplicando a quantidade de hematoxilina e de iodato de sódio, e quadriplicando a quantidade de sulfato de alumínio.
Hematoxilina de Weigert
Por vezes em certas colorações especiais, ou de histoquímica, é necessário utilizar uma hematoxilina férrica como corante nuclear. A hematoxilina férrica é assim denominada por ser utilizado o cloreto de ferro ou o sulfato de amónio e ferro (também chamado de sulfato férrico de amónio ou alúmen de ferro ou alúmen férrico) como mordentes. Estes reagentes também atuam como agentes oxidantes convertendo a hematoxilina em hemateína. Por esta razão, esta solução deve ser preparada extemporânea caso contrário a hematoxilina será sobre-oxidada.
Este tipo de hematoxilina resiste à descoloração em soluções ácidas, pelo que é particularmente útil quando é necessário colocar em evidência certos componentes do citoplasma e da matriz extracelular, como por exemplo fibras conjuntivas, substância osteóide, etc. Um exemplo deste tipo de coloração, o van Gieson, utiliza ácido pícrico que é um reagente fortemente ácido, que dissolve o complexo hematoxilina-alúmen, provocando a sua dissolução.
Tempo de coloração 5 a 15 minutos.
Este corante está disponível para compra em solução comercial pronta a usar.
Reagentes
Solução A
Hematoxilina ………………………………. 1 g
Álcool a 99,9% (100%) ………………… 100 mL
Esta solução pode ser utilizada imediatamente.
Solução B
Cloreto de ferro a 30% (FeCl3) anidro …………………….. 4 mL
Água destilada …………………………………………………….. 95 mL
Ácido clorídrico a 37% ………………………………………….. 1 mL
Preparação da solução
Armazenar as soluções A e B separadamente.
Juntar, imediatamente antes de usar, partes iguais da solução A e B (Hematoxilina de Weigert).
A cor da mistura deve ser preto-arroxeado profundo. Se for castanho-avermelhado, não utilizar.
A solução de hematoxilina é estável durante 2 a 3 dias.
NOTA: Nesta solução, a solução A é o corante e a solução B o mordente.
Como contornar a falta de hematoxilina férrica no laboratório?
Em 1940, Lendrum and McFarlane propuseram o uso sequencial de dois corantes (o azul celeste e hematoxilina de alúmen), como forma alternativa de coloração nuclear resistente à descoloração por soluções ácidas. A hematoxilina protocolada foi a de Mayer, no entanto a hematoxilina de Harris também pode ser utilizada.
Este corante está disponível para compra em solução comercial pronta a usar.
Reagentes
Azul celeste B …………………………………………………….. 0,5 g
Sulfato de amónia e ferro NH4Fe(SO4)2 ………………. 5 g
Água destilada ……………………………………………………. 100 mL
Glicerina …………………………………………………………….. 14 mL
Preparação da solução
Dissolver o sulfato de amónia e ferro na água destilada.
Colocar no agitador magnético até o reagente estar completamente dissolvido.
Adicionar o azul celeste B.
Colocar no agitador magnético até o reagente estar completamente dissolvido.
A solução deve ficar azul-escuro.
Filtrar e adicionar a glicerina.
A solução é estável durante 6 meses.
Como “substituto” da hematoxilina de weigert:
Corar o tecido com o azul celeste durante 5 minutos.
Lavar em água corrente.
Corar com hematoxilina de Mayer (ou Harris) durante 5 minutos.
Lavar em água corrente.
Prosseguir com os passos seguintes da coloração pretendida.
