Após a etapa da microtomia, os cortes histológicos apresentam-se incolores. Para que a visualização e estudo dos elementos químicos e componentes tecidulares ao microscópio ótico seja possível, é necessário que eles sejam corados. A este estudo designa-se de histoquímica.
De facto, todos os tecidos de origem animal são incolores, a menos que contenham algum tipo de pigmento. Exemplos desta pigmentação incluem a melanina, na pele, que pigmenta a epiderme de um castanho granular, ou a hemoglobina, no sangue e em tecidos vascularizados, que lhes confere coloração vermelha / rosa.
A coloração histoquímica visa contrastar as estruturas tecidulares para sua posterior visualização microscópica.
A maioria dos mecanismos de coloração baseiam-se na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos corantes com os elementos químicos dos tecidos. Existem no entanto outros tipos de corantes, que serão descritos em cada um dos protocolos.
Na ligação corante-tecido podem estar envolvidas interações (ligações) iónicas, ligações de hidrogénio e ligações covalentes. Contudo, as colorações de histoquímica também são baseadas na adsorção do corante ou de certas partículas em solução por certos componentes tecidulares.
Interações iónicas ou eletrostáticas
Uma interação iónica envolve forças eletrostáticas que atraem iões de cargas opostas. Neste tipo de interação, a transferência de eletrões é definitiva. Em histologia, o corante e os componentes tecidulares possuem cargas diferentes e por isso são atraídos um pelo outro. A título de exemplo, o citoplasma pode ser corado se for desenvolvida carga positiva nas proteínas citoplasmáticas e carga negativa no corante. Também se pode designar este tipo de ligação como ligação salina.
Ligações covalentes
Ligações de hidrogénio
Este tipo de ligação pode ocorrer entre moléculas (intermolecular) ou dentro da mesma molécula (intra-molecular). O hidrogénio de uma molécula constitui um polo positivo, que se liga a um dos átomos de flúor, oxigénio ou nitrogénio de outra molécula, que constituem o polo negativo delas.
Ligações de van der Waals
As forças intermoleculares, também chamadas de forças de van der Waals, surgem de uma atração eletrostática entre nuvens de electrões e núcleos atómicos (forças que existem entre as moléculas). São fracas, quando comparadas com as ligações covalentes ou iónicas, mas fortes o suficiente para permitir que o DNA tenha a configuração de dupla-hélice. Desta forma, é necessário menos energia para vaporizar um líquido ou fundir um sólido do que para quebrar ligações covalentes em moléculas.
Sabe-se que existem três tipos de forças atrativas entre moléculas neutras: forças dipolo–dipolo, de dispersão de London e de ligação de hidrogênio. Essas forças são também chamadas forças de van der Waals em homenagem a Johannes van der Waals, que desenvolveu a equação para determinar o desvio de gases do comportamento ideal.
As substâncias têm características diferentes dependendo do tipo de ligações que as formam.
Características dos compostos iónicos:
Apresentam forma definida, são sólidos nas condições normais
Possuem altos pontos de fusão e de ebulição
Dissolvem-se em água
Conduzem corrente elétrica quando fundidos ou dissolvidos em água
Características dos compostos covalentes:
Podem ser encontrados nos três estados físicos
Apresentam ponto de fusão e ponto de ebulição menores que os compostos iónicos
Não se dissolvem em água
Quando puros, não conduzem eletricidade
Corantes
Os corantes são moléculas com sistemas de electrões deslocalizados conjugados com ligações duplas, contendo dois grupos: cromóforo e auxocromo. Os cromóforos são grupos de átomos responsáveis pela cor do corante, possuindo grupos aceitadores de electrões. Os cromóforos mais importantes são os grupos (-C=C-), (-C=N-), (-N=N-), (-NO2) e (-NO). Os auxocromos são grupos substituintes com grupos dadores de electrões, que intensificam a cor do cromóforo e têm a capacidade de ligar o cromogéneo à substância a ser corada. Os cromogénios podem ser grupos amina, átomos de azoto quaternários, grupos ácido sulfónico e grupos carboxilo (NH2, -NR2, -NHR, -COOH, -SO3H, -OH e -OCH3).
O uso do termo ácido e básico em histoquímica pode ser confuso, pois no que toca a corantes esta definição não tem nada a ver com o pH.
Um corante básico é o que tem carga total positiva. Também são chamados de corantes catiónicos e o seu grupo auxocromo é um grupo amino (NH2). Um corante ácido é o que tem carga total negativa. Também são chamados de corantes aniónicos e o seu grupo auxocromo é por norma um grupo sulfónico (SO3).
A maioria dos corantes utilizados em histologia são sais, constituídos por um componente básico e um ácido. Designa-se de coloração básica quando a base do corante contém o cromóforo combinado com radical ácido (por exemplo, Cl, SO3). A fucsina básica é composta por uma base colorida (rosanilina) e pelo radical ácido incolor (Cl).
Designa-se de coloração ácida quando o ácido do corante contém o cromóforo combinado com a base (incolor). A base é normalmente um sal. Uma coloração neutra é produzida pela interação de um corante ácido e de um básico, pelo cada uma das moléculas do corante (ácido e base) contem um grupo cromóforo. Estas soluções das colorações neutras são muitas vezes coloidais.
Metacromasia
Certos componentes tecidulares combinam-se com o corante para produzirem uma cor diferente da cor original do corante. Estes componentes também adquirem coloração diferente do resto do tecido corado.
Os corantes que atuam desta forma designam-se de metacromáticos. Um componente tecidular que altera a cor dum corante metacromático designa-se de crómotropo. O termo ortocromático pode ser utilizado para designar um tecido sem capacidade metacromática ou um corante que não é metacromático.
Os tecidos metacromáticos mais importantes são: cartilagem, tecido conjuntivo, mucinas epiteliais, grânulos dos mastócitos e amilóide. Para que a metacromasia aconteça é necessário que existam grupos eletronegativos livres no tecido. Este facto ocorre principalmente em polissacarídeos ácidos sulfatados.
Os corantes metacromáticos são principalmente as tiazinas, como por exemplo o azul de toluidina e a tionina.
O álcool converte a forma polimerizada do corante (metacromática) num componente monomérico (ortocromático), pelo que a metacromasia é perdida se o corte de tecido é desidratado em álcool após esta coloração ser efetuada.
Policromasia
As colorações policromáticas podem ser executadas por corantes compostos por vários reagentes ou por uma mistura de corantes que contém componentes de diferentes cores. Estas colorações são vulgarmente utilizadas em tecido de medula óssea, devido à variedade de coloração citoplasmática alcançada.
Policromasia é o processo pelo qual um único corante forma outros corantes espontâneamente. Incluem-se nesta categoria, por exemplo, o azul de metileno e o Giemsa. O Giemsa entra na categoria de coloração do tipo Romanowsky, e é uma combinação de azul de metileno (corante básico) e de eosina (corante ácido).
