Perl’s

Autor: Ruben Gouveia. Ver página autores. Última edição: Pathologika, 22 de Dezembro de 2019. Citar esta página: Gouveia, R., Histoquímica. Van Gieson – Pathologika. Available at: https://pathologika.com/histoquimica/perls/ [Acedido: data].

Objetivo / Princípio

O método de Perl’s é utilizado para a deteção de ferro férrico (Fe 3+ ) em tecidos histológicos [1-7].
Este método, detecta os iões férricos em complexos proteicos com ligações fracas (como na hemossiderina), não havendo uma reação positiva quando as ligações são fortes (por exemplo na hemoglobina) [1]. O ácido hidroclorídrico vai permitir libertar os iões férricos, que vão posteriormente reagir com o ferrocianeto de potássio, formando um composto azul insolúvel. Este composto é denominado de ferrocianeto férrico, também conhecido como azul da Prússia [1-4].

São obtidos melhores resultados se for colocado primeiro o ferrocianeto de potássio e depois se adicionar o ácido hidroclorídrico. Isto deve-se ao facto de o ferrocianeto de potássio se difundir mais lentamente que o ácido hidroclorídrico. Se forem colocados ao mesmo tempo, o ferrocianeto de potássio pode chegar demasiado tarde para reagir com os iões de ferro nos locais onde são formados, havendo uma difusão dos mesmos no tecido. Esta modificação, permite que, na presença de ferro férrico, o ferrocianeto de potássio já esteja presente no tecido e reaja com os iões de ferro no local onde são libertados, evitando a sua difusão e, consequentemente, uma falsa localização [3-5].

Curiosidades

Este método é considerado uma das técnicas de histoquímica mais antigas [2,4].
Este método não é considerado uma coloração, mas sim uma reação histoquímica, uma vez que, a combinação química de um constituinte do tecido (ferro férrico) com uma substância química (ferrocianeto de potássio), dá origem a um composto colorido (ferrocianeto férrico ou azul da Prússia). O produto final tem cor mas não é um corante. Ou seja, este método é uma reação química simples, em que o seu produto – azul da Prússia – não é um corante, é um precipitado/depósito colorido e insolúvel [5].

O ferro férrico encontra-se normalmente em pequenas quantidades na medula óssea e no baço, no entanto, depósitos anormalmente grandes de ferro férrico podem ser vistos em casos de hemocromatose e hemossiderose [1].

O ferro aparece nos tecidos quase exclusivamente no estado férrico [2,3,5,6]. A reação de precipitação deste método não é específica para o ferro, uma vez que, a maioria dos metais pesados origina um precipitado [6]. No entanto, a cor do precipitado é característica do ferro, podendo a cor servir de guia para identificação de outros metais [6].

O cobre, por exemplo, vai formar um precipitado castanho avermelhado, podendo ser demonstrado por este método. Contudo, a quantidade de ferro presente em tecidos de mamíferos é muito superior à de cobre, fazendo com que na maioria dos casos o precipitado azul do ferro obscureça o precipitado do cobre [3,6].

Fixação

A fixação em formol neutro tamponado dá bons resultados [1,3,4,5,7]. Podem ser utilizados outros fixadores, mas devem ser evitados fixadores ácidos [1-5], pois vão interferir com a preservação do ferro [2,4] e causar uma maior difusão do ferro no tecido [3,4]. O mesmo se aplica a dicromatos [2,5].

A difusão pode levar a uma falsa localização do ferro, porque algumas estruturas (especialmente os núcleos e, em menor grau, as fibras de colagénio) têm uma elevada afinidade para o ferro férrico, mesmo que em pequenas quantidades [3,4].

Microtomia

Pode ser utilizado qualquer tipo de meio de impregnação/inclusão [2,5], inclusive resinas [2].

Para processamento em parafina, efetuar cortes a 4-5 µm [1].

Controlo de qualidade

É essencial utilizar um controlo positivo [1,2]. O controlo não deve ter muita quantidade de ferro, uma vez que, sendo o produto da reação ligeiramente solúvel, pode contaminar os restantes cortes, causando marcação de fundo inespecífica[1]. Um bom controlo positivo é pulmão post mortem, que contém um número razoável de macrófagos com hemossiderina (células da falha cardíaca) [2]. Depósitos de ferro formados recentemente podem-se dissolver com o ácido hidroclorídrico [2].

Reagentes e soluções

Diversos autores sugerem diferentes modos de preparação dos reagentes:

  • Carson, F.L. (ver Histotechnology: a Self-Instructional Text).
  • Bancroft, J.D., Gamble, M. e Suvarna, S.K. ( ver Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques).
  • Davenport, H. ( ver Histological and Histochemical Technics).
  • Prophet, E.B. e Armed Forces Institute of Pathology (ver Armed Forces Institute of Pathology: Laboratory Methods in Histotechnology).

Notas prévias ao procedimento

  • Nenhum dos materiais ou reagentes utilizados deve conter ferro para não haver artefactos na coloração ou marcação de fundo [1,4,5]. Por esse motivo, deve ser evitado o uso de água da torneira [4].
  • O ferro pode ser dissolvido  quando se utilizam fixadores ácidos ou descalcificadores; no entanto, ainda é possível demonstrar a presença de ferro férrico em biópsias ósseas que são fixadas overnight na solução de Zenker com ácido acético a 3%. Deste modo, tanto a fixação como a descalcificação são conseguidas, não se perdendo o ferro. Como a solução de Zenker contém mercúrio, é preferível que seja utilizado outro fixador e depois se descalcifique brevemente em ácido acético ou ácido fórmico a 3-5% [1].
  • Aquecer a solução de ferrocianeto a 55ºC produz uma coloração mais forte [5], mas pode criar um depósito granular azul nos cortes [1,2,5]. No entanto, aquecer a 37ºC na estufa não causa artefactos [6].
  • A coloração desvanece com o tempo em lâminas montadas com bálsamo, mas geralmente é permanente com meios de montagem sintéticos [4,5]. Caso esteja a desvanecer, tratá-la com peróxido de hidrogénio a 10 vol. reavive a coloração [5].
  • O contraste não deve ficar demasiado forte para não obscurecer a marcação do ferro férrico [1,4].
  • Uma vez feitas, as soluções de ferrocianeto de potássio e de ácido hidroclorídrico não devem ser armazenadas durante muito tempo, de forma a manterem a sua viabilidade [2].

Procedimento técnico

Nota: existem no mercado empresas que comercializam estas soluções já prontas a serem utilizadas, assim como kits de coloração completos.

Diversos autores sugerem diferentes procedimentos:

  • Carson, F.L. (ver Histotechnology: a Self-Instructional Text).
  • Bancroft, J.D., Gamble, M. e Suvarna, S.K. ( ver Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques).
  • Gomori, G. (ver Microscopic Histochemistry: Principles and Practice).
  • Bruce Casselman, W. G. (ver Histochemical Technique).
  • Carleton, H.M., Drury, R.A.B. e Wallington, E.. A. (ver Carleton’s Histological Technique).
  • Davenport, H. ( ver Histological and Histochemical Technics).
  • Prophet, E.B. e Armed Forces Institute of Pathology (ver Armed Forces Institute of Pathology: Laboratory Methods in Histotechnology).

Resultados

Ferro férrico …………………………….….. Azul [1-7]

Alguns óxidos e sais de ferro ……….. Azul [5,7]

Núcleo e citoplasma …………………..De acordo com o contraste utilizado [1-6].


Referências bibliográficas

  1. Carson, F.L., 1997. Histotechnology: a self-instructional text. 2ª
    ed., ASCP Press.
  2. Bancroft, J.D., Gamble, M. & Suvarna, S.K., 2012. Bancroft’s
    Theory and Practice of Histological Techniques. 7a., Elsevier
    Churchill Livingstone.
  3. Gomori, G., 1952. Microscopic Histochemistry: principles and
    practice. The University of Chicago Press.
  4. Calsseman, W.G., 1959. Histochemical Technique. 1ª., Methuen &
    Co Ltd.
  5. Carleton, H.M., Drury, R.A.B. & Wallington, E.. A., 1976. Carleton’s
    Histological Technique. 4a., Oxford University Press.
  6. Davenport, H.A., 1960. Histological and Histochemical Technics.
    W. B. Saunders Company.
  7. Prophet, E.B. & Armed Forces Institute of Pathology, 1992.
    Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, DC.
    American Registry of Pathology.