Os métodos de coloração imunoenzimáticos utilizam as reacções enzima-substrato para converterem os cromogénios incolores em produtos finais coloridos, adequados a serem observados por microscopia óptica. Além disso, a variedade de enzimas e cromogénios disponíveis permitem ao utilizador a escolha de cor para o produto final da reacção.
Enzimas são moléculas proteicas (proteínas) com actividade catalítica e que aceleram de forma repetida e constante reacções bioquímicas específicas, sem no entanto sofrerem modificações permanentes ou serem consumidas no processo.
Dado que as enzimas não são consumidas na reacção com o substrato, o produto final pode acumular-se no local do antigénio alvo.
A viabilidade de determinada enzima ser utilizada como marcador em imunohistoquímica, depende de várias características:
- A enzima disponível deve estar altamente purificada e ser relativamente barata.
- Após a conjugação (ligação covalente) da enzima a um anticorpo ou da ligação não-covalente da enzima ao substrato, a enzima deve ser estável e manter a sua actividade.
- Gerar um produto de reacção insolúvel, estável e detectável.
- O produto de reacção deve precipitar no local da sua produção.
- A enzima conjugada deve ser estável em solução e à temperatura ambiente.
A horseradish peroxidase (peroxidase de rábano) e a fosfatase alcalina são as enzimas mais utilizadas em imunohistoquímica. A glucose oxidase, devido à sua baixa sensibilidade, é raramente utilizada.
Horseradish Peroxidase – HRP
É a enzima mais utilizada em imunohistoquímica por possuir várias das características anteriormente descritas.
Esta enzima é isolada a partir da raiz da planta de rábano (Cochlearia armoracia). É uma glicoproteína com 18% de carbohidratos na sua constituição e 40 kDa de peso molecular. Uma vez que esta enzima existe nos mamíferos, significa que existe actividade enzimática endógena, sendo necessária a sua inibição para se efectuar a técnica de imunohistoquímica. Se esta inibição não for efectuada, existe a probabilidade de ocorrer marcação inespecífica.
A HRP contem um grupo heme contendo ferro (hematina) no seu centro activo. Durante a reacção da enzima, o peróxido de hidrogénio – H202 (substrato para a peroxidase) forma um complexo primário com a hematina (complexo enzima-substrato), que na presença de um dador de electrões (cromogénio) se dissocia em água e oxigénio atómico. Esta reacção provoca a regeneração da enzima e a precipitação do cromogénio oxidado. O dador de electrões fornece a força motriz para a catálise contínua de H202, enquanto a sua ausência determina o final da reacção.
O cromogénio mais favorável da HRP é a 3,3’ diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), que após oxidação forma um polímero castanho, insolúvel e estável no local do antigénio alvo. Este facto permite a reacção com o tetróxido de ósmio, o que aumenta a intensidade da cor e da densidade para os electrões (útil em microscopia electrónica).
O complexo formado entre a HRP e o excesso de peróxido de hidrogénio é cataliticamente inactivo e na ausência de um dador de electrões (por exemplo o cromogénio), é inibido. É o peróxido de hidrogénio em excesso e ausência de um dador de electrões que provoca a supressão da actividade da peroxidase endógena .
São vários os cromogénios disponíveis para a horseradish peroxidase, entre os quais se incluem:
- 3,3’ diaminobenzidine trahydrochloride (DAB)
- 3-amino-9-etilcarbazole (AEC)
- 4-cloro-11-naftol (CN)
- Reagente de Hanker-Yates ou p-phenylenediamine dihydrochloride/pyrocatechol
- pironina α-naftol
Alguns destes cromogénios produzem produtos de reacção que são solúveis em álcool e xilol o que implica o uso de meio de montagem aquoso (Tabela I2).
Como intensificar a coloração castanha do DAB?
Se durante a reacção de oxidação fôr adicionado sulfato de cobre é possível intensificar a côr do polímero castanho. Se fôr adicionado cloreto de níquel, o polímero castanho pode ser transformado em negro.
Tabela I2 – Marcadores e cromogénios mais utilizados em imunohistoquímica
Calf intestine alkaline phosphatase (Fosfatase alcalina)
A fosfatase alcalina intestinal é uma das enzimas mais amplamente utilizadas em imunohistoquímica, particularmente com o desenvolvimento do método fosfatase alcalina fosfatase anti-fosfatase alcalina (APAAP) em 1984.
Enquanto marcador, uma vez que existe nos mamíferos, significa que existe actividade enzimática endógena, sendo necessária a sua inibição.
Neste método, a enzima hidrolisa os ésteres de fosfato de naftol (substrato) em compostos fenólicos e fosfatos. O fenóis reagem com os sais incolores de diazonium (cromogénio) para produzir corantes azo insolúveis.
São várias as combinações de diferentes substratos e cromogénios que têm sido utilizadas com sucesso para a enzima fosfatase alcalina, entre as quais se incluem:
- 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP) [substrato] + Nitro Blue Tetrazolium (NBT) [cromogénio]
- naphthol AS-MX phosphate [substrato] + Fast red TR [cromogénio]
- naphthol AS-MX phosphate [substrato] + Fast blue BB [cromogénio]
- naphthol AS-MX phosphate [substrato] + New Fuchsin [cromogénio]
Podem também ser utilizados naphthol AS-BI phosphate, naphthol AS-TR phosphate como substratos e Fast Red LB, Fast Garnet GBC e Iodonitrotetrazolium Violet (INT) como cromogénios nas suas diversas combinações.
Alguns destes cromogénios produzem produtos de reacção que são solúveis em álcool e xilol o que implica o uso de meio de montagem aquoso (Tabela I2).
Glucose Oxidase (Aspergillus niger)
Esta enzima é pouco e cada vez menos utilizada em imunohistoquímica, uma vez que possui pouca sensibilidade quando comparada com a fosfatase alcalina e com a peroxidase.
Enquanto marcador, uma vez que não existe nos mamíferos, significa que não existe actividade enzimática endógena, não sendo necessária a sua inibição.
