As técnicas de imunohistoquímica são utilizadas para demonstrar a presença de antigénios em tecidos e células. O facto de as imunoglobulinas poderem atuar tanto como anticorpos (ligando-se especificamente aos antigénios do tecido) como antigénios (providenciando determinantes antigénicos aos quais se podem ligar anticorpos secundários), permitiu que fossem desenvolvidas vários métodos (técnicas) para visualizar o antigénio alvo.
A base dos sistemas de deteção é o reconhecimento específico do antigénio pelo anticorpo, seguindo-se a sua visualização. Esta deteção é alcançada com a incubação do anticorpo primário anti o antigénio pretendido no tecido. É seguida da aplicação com os reagentes incluídos no sistema de deteção, que agregam certos marcadores aos anticorpos primários ou secundários. O passo final é a visualização desta ligação com a aplicação do cromogénio.
Em todos os métodos imunohistoquímicos, o essencial é conseguir a máxima quantidade de marcador no local do antigénio alvo com o mínimo de background.
São vários os métodos em imunohistoquímica que nos permitem detetar o antigénio pretendido no tecido do paciente. Atualmente, as técnicas imunohistoquímicas podem ser efetuadas em equipamentos completamente automatizados, embora a técnica manual seja ainda amplamente executada.
Método direto
Neste método, o anticorpo primário é conjugado diretamente com o marcador (fluorocromo ou enzima). Desta forma, o anticorpo marcado reage diretamente com o antigénio na amostra de histologia ou de citologia, permitindo assim a sua visualização (Figura I8).
Esta técnica é mais utilizada em imunofluorescência para demonstração de imunoglobulinas e complemento em cortes de congelação de amostras de pele e biópsia renal.
Como desvantagens deste método, referem-se a pouca amplificação de sinal assim como a pouca sensibilidade alcançada quando comparado a outros métodos. Convém mencionar que a pouca quantidade de antigénio presente em certos tumores podem não ser detetados por esta técnica.
Figura I8 – Método direto.
Método indireto
Neste método, é aplicado na amostra um anticorpo primário não conjugado (anti o antigénio que queremos visualizar), seguido de um anticorpo secundário conjugado com um marcador (Figura I9). Salienta-se que o anticorpo secundário deve ser dirigido à espécie animal em que o anticorpo primário foi produzido, ou seja, se o anticorpo primário é de rato, o anticorpo secundário deve ser, por exemplo, coelho anti-rato.
Este método é mais sensível do que o método direto porque os múltiplos anticorpos secundários podem reagir com diferentes locais antigénicos no anticorpo primário, aumentando assim a amplificação de sinal.
Figura I9 – Método indireto.
Método Peroxidase Anti-Peroxidase
Para que o anticorpo secundário (anticorpo ponte) se possa ligar tanto ao anticorpo primário como ao complexo peroxidase anti-peroxidase (PAP), o complexo PAP deverá ser produzido na mesma espécie animal do anticorpo primário (Figura I10).
O anticorpo secundário deve ser aplicado em excesso para que uma porção Fab se ligue ao anticorpo primário e a outra porção Fab se ligue ao complexo PAP.
Figura I10 – Método PAP.
Método Fosfatase Alcalina Anti-Fosfatase Alcalina
Para que o anticorpo secundário (anticorpo ponte) se possa ligar tanto ao anticorpo primário como ao complexo fosfatase alcalina anti-fosfatase alcalina (APAAP) , o complexo APAAP deverá ser produzido na mesma espécie animal do anticorpo primário (Figura I11).
O anticorpo secundário deve ser aplicado em excesso para que uma porção Fab se ligue ao anticorpo primário e a outra porção Fab se ligue ao complexo APAAP.
Figura I11 – Método APAAP.
Métodos de Avidina e Biotina
Complexo avidina-biotina (ABC) OU streptavidina-biotina (sABC)
De acordo com Elias (1988), para a época, um dos métodos mais sensíveis utilizados para o diagnóstico imunocitoquímico envolve o uso da avidina e da biotina. Os métodos de avidina-biotina foram desenvolvidos por Guesdon, Ternynck e Avrameas em 1979, mas o seu aperfeiçoamento foi efetuado em 1981 por HSU, Raine e Fanger.
Estes métodos baseiam-se na elevada afinidade da molécula tetravalente avidina (glicoproteína com 68kD extraída da clara do ovo) para a biotina.
Por esta afinidade ser mais de um milhão de vezes superior que a do anticorpo para o antigénio, esta ligação é praticamente irreversível o que permite a formação de complexos avidina-biotina particularmente estáveis. Tanto a biotina como a avidina podem ser conjugadas covalentemente com anticorpos ou com marcadores, como por exemplo fluorocromos, enzimas ou ouro coloidal. No entanto, é a biotina a geralmente conjugada aos anticorpos devido ás suas reduzidas dimensões (Rainbow, 1994). Cada anticorpo pode conjugar até 150 moléculas de biotina, o que permite a ligação de vários complexos e explica a elevada sensibilidade deste método na deteção do antigénio alvo. De referir que a biotinilação do anticorpo secundário não reduz a eficácia da sua atividade (HSU, Cossman, Jaffe, 1983).
No entanto, a avidina possui resíduos oligossacarídeos na sua estrutura. Estes elementos induzem a ligação da avidina a estruturas tecidulares de carga elétrica negativa, o que provoca marcação de fundo inespecífica. Para ultrapassar este problema, começou a ser utilizada a streptavidina.
A streptavidina é uma proteína de 60 KD, extraída da cultura de Streptomyces avidinii, que não possui resíduos oligossacarídeos, pelo que não induz marcação de fundo inespecífica.
A execução deste método consiste na incubação do anticorpo primário, seguido de um anticorpo secundário biotinilado e do complexo streptavidina-biotina conjugado com a enzima horseradish peroxidase (HRP) (Figura I12).
Quando se utilizam sistemas de deteção baseados neste método em tecidos ricos em biotina endógena (fígado, tecido adiposo, mama e rim), torna-se necessário efetuar o seu bloqueio de modo a evitar o aparecimento de resultados falsamente positivos (Wood e Warnke, 1981).
A preparação do complexo sABC pode ser efetuada até 3 horas antes da sua incubação. É adicionada streptavidina e biotina marcada com a enzima para que as duas moléculas se liguem. A quantidade de cada reagente adicionado deve proporcionar que exista uma zona livre na streptavidina por cada três ocupadas com biotina marcada, para que o complexo se possa ligar à biotina do anticorpo secundário.
Figura I12 – Método sABC (streptavidina-biotina)
Complexo Labelled Streptavidin Biotin (LSAB)
Uma variante ao complexo ABC ou sABC, consiste em não utilizar biotina conjugada com a avidina ou a streptavidina. Neste método, a streptavidina é conjugada diretamente com a enzima (Figura I13).
Figura I13 – Método LSAB.
Método do polímero
Esta metodologia utiliza uma cadeia de dextrano, conjugada com anticorpos e enzimas. Cada cadeia de dextrano pode ter até 70 moléculas de enzima e 10 moléculas de anticorpo ligado. Este composto é facilmente solúvel em água e eletrólitos, constituindo soluções incolores, transparentes e altamente estáveis.
O facto destes sistemas não possuírem avidina / streptavidina nem biotina na sua constituição, torna-se desnecessário efetuar o bloqueio da biotina endógena.
Método Enhanced Polymer One-Step Staining (EPOS)
Esta tecnologia utiliza um anticorpo primário conjugado a uma cadeia de polímero (dextrano), marcada com uma enzima (peroxidase de rábano) o qual se liga diretamente ao antigénio no tecido (Figura I14). Um bom exemplo deste método é o Enhanced Polymer One-Step Staining (EPOS).
Figura I14. Método EPOS
Método indireto
Neste método, os polímeros são ligados de forma indireta ao anticorpo primário, ou seja, em primeiro lugar incuba-se o anticorpo primário no tecido e depois é adicionado o polímero (Figura 15). Desta forma, a cadeia de dextrano, além da enzima, é também conjugada com anticorpos secundários. Estes anticorpos secundários reconhecem tanto anticorpos primários produzidos em rato (anti-rato) como anticorpos primários produzidos em coelho (anti-coelho), o que permite que o mesmo reagente possa ser utilizado para detetar tanto anticorpos primários monoclonais (de coelho e de rato) assim como anticorpos primários policlonais (coelho).
Figura I15 – Método polímero indireto.
Micropolímeros ou multímeros
Nesta tecnologia, a enzima é diretamente conjugada ao anticorpo secundário por micropolímeros, eliminando a molécula de polímero maior (dextrano) que pode limitar a funcionalidade e sensibilidade do método (figuras I16 e I17).
Como a molécula de multímero é mais pequena, penetra facilmente no tecido o que facilita a ligação de mais multímeros ao anticorpo primário. Este processo aumenta a sensibilidade de marcação deste método, o que se torna uma grande mais valia em tecidos com baixos níveis de antigénio alvo.
Figura I16 – Método micropolímero
Uma variante a este método do micropolímero, consiste num passo intermédio de incubação com um anticorpo secundário para amplificação de sinal.
Figura I7 – Método micropolímero em 2 passos.
Além destas, que são as mais utilizadas, existem outras metodologias utilizadas em imunohistoquímica para deteção do antigénio alvo. A última década foi de grande evolução e descoberta nestas técnicas, com o objetivo de ser detetado o antigénio alvo, mesmo quando presente em ínfimas quantidades no tecido do doente. E a evolução continuará, sempre com um único objetivo presente: a deteção do antigénio alvo para um diagnóstico e terapêutica corretos.
Dupla imunohistoquímica com multímero
Para deteção simultânea de dois anticorpos no mesmo fragmento de tecido, existem duas formas de se efetuar a dupla imunohistoquímica:
- imunohistoquímica simultânea
- imunohistoquímica sequencial
Imunohistoquímica dupla simultânea
Neste método, a incubação dos anticorpos é efetuada simultâneamente no mesmo fragmento de tecido. A figura I8 esquematiza o método. Com este método, podem devem utilizar-se anticorpos produzidos em espécies diferentes.
Figura I8: Imunohistoquímica dupla simultânea
Imunohistoquímica dupla sequencial
Neste método, são efetuadas duas técnicas de imunohistoquímica sequencialmente no mesmo fragmento de tecido. A figura I9 esquematiza o método. Com este método, podem utilizar-se anticorpos produzidos na mesma espécie ou em espécies diferentes.
Figura I9: Imunohistoquímica dupla sequencial